那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于蛋白質(zhì)純化方法經(jīng)典攻略（二）：
初始樣品制備
無(wú)論目標(biāo)蛋白的來(lái)源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的制備很重要。同時(shí)也需要考慮表達(dá)和純化策略。
目標(biāo)蛋白的胞外分泌可使用簡(jiǎn)單快速親和純化方案；所需的唯*yi樣品制備可能需要傾倒貼壁細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或者低速離心以去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)然，制備過(guò)程的**步色譜層析時(shí)可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調(diào)節(jié)pH，但這些步驟簡(jiǎn)單易行。然而，如果**步純化樣品步驟進(jìn)行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽。當(dāng)處理大量條件培養(yǎng)基時(shí)可能會(huì)有技術(shù)難度；根據(jù)培養(yǎng)基的脫鹽體積常可采用透析或錯(cuò)流過(guò)濾。
如果靶蛋白在胞內(nèi)表達(dá)，則細(xì)胞首先需要通過(guò)離心獲取，然后用合適的裂解緩沖液重懸。如上所述，裂解緩沖液需要包含合適的緩沖液和其它添加劑以確保靶蛋白的*大穩(wěn)定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時(shí)的緩沖液交換步驟，則樣品/裂解緩沖液的組成也需與隨后的純化步驟相適宜。
接下來(lái)，需要有效的細(xì)胞裂解方法。大腸桿菌可以通過(guò)弗氏壓碎器裂解（盡管這種方法不容易規(guī)?；?，超聲或基于洗滌劑的裂解（有很多商業(yè)裂解試劑）。通過(guò)向裂解緩沖液中加入溶菌酶可以改善基于洗滌劑的裂解效率。基于洗滌劑的裂解非常溫和，且不導(dǎo)致細(xì)*菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產(chǎn)生具有良好流動(dòng)特性的樣品，通常需要加入含DNA酶（高純度制劑可商購(gòu)）。
哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞也可以通過(guò)超聲或基于洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要DNA酶處理降低樣品粘度。
一旦細(xì)胞（微生物/昆蟲/哺乳動(dòng)物）被裂解，通常需要離心除去細(xì)胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，以避免色譜柱堵塞）。所得上清液即可開始用于靶蛋白的柱色譜層析純化。
柱層析設(shè)備柱層析的基本原理是將一份蛋白質(zhì)混合物分成很多小份，從而使某些組分中目標(biāo)蛋白的濃度通過(guò)濃縮得以增大。雖然已經(jīng)有很多昂貴和特殊的設(shè)備可用于柱層析，但實(shí)際上它只需要*基本的設(shè)備即可。
基本柱層析設(shè)備1、固定相：一種惰性介質(zhì), 通常帶有一種可促進(jìn)蛋白質(zhì)相互作用的官能團(tuán)以進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。固定相和官能團(tuán)的選擇取決于層析色譜和方法的種類。
2、柱子：一種圓柱形玻璃容器，長(zhǎng)度和直徑各不相同。柱子可以直接購(gòu)買已填裝固定相能直接連接到層析設(shè)備上使用的預(yù)裝柱，或可購(gòu)買空柱自己手動(dòng)填裝。自動(dòng)層析設(shè)備和人工重力柱使用的是不種類型的柱子。
3、溶劑：含有添加劑的緩沖液，作為將蛋白質(zhì)在固定相上平衡和洗脫的流動(dòng)相。不同類型的柱層析需要不同的溶液條件。
4、收集管：用于收集洗脫液樣品的容器。自動(dòng)組分收集器需要特定的收集管。手動(dòng)收集時(shí)，則試管或容器均可使用。
5、純度檢測(cè)方法：一種檢測(cè)樣品里所有蛋白質(zhì)中目標(biāo)蛋白相對(duì)含量的檢測(cè)手段。每一步獲得的含有目標(biāo)蛋白的組分都必須在進(jìn)行下一步純化工作前進(jìn)行檢測(cè)。后面的章節(jié)將對(duì)一些常用的純度分析方法進(jìn)行討論。
層析系統(tǒng)柱層析可以依賴用泵將溶劑以固定流速打入填裝好的層析柱的自動(dòng)設(shè)備來(lái)完成或者依靠流動(dòng)相的重力作用自己完成。自動(dòng)系統(tǒng)或者重力柱系統(tǒng)均可與自動(dòng)組分收集器連接使用。
| 系統(tǒng)類型 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
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親和層析的固定相是一種共價(jià)結(jié)合特異性配體的惰性介質(zhì)，該配體可與一個(gè)蛋白質(zhì)或一類蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。惰性介質(zhì)通常是交聯(lián)的瓊脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白質(zhì)可采用選擇性或非選擇性模式來(lái)進(jìn)行親和柱層析純化。在選擇性親和柱層析中，一般使用對(duì)蛋白質(zhì)有特異性作用的配體或共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽。在非選擇性親和柱層析中，如用于免*疫球蛋白純化的蛋白A、G、L，用于DNA結(jié)合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，這些配體與一類蛋白都具有相似的結(jié)合能力。
圖 4. 用蛋白A、G、L進(jìn)行親和層析的原理示意圖：A.抗體含有多個(gè)功能區(qū)：一類蛋白質(zhì)的Fc區(qū)（片段，恒定區(qū)） 都是相同的，F(xiàn)v區(qū)（片段，可變區(qū)）是每個(gè)抗體各不相同的特異區(qū)，F(xiàn)ab（片段，抗原區(qū)）是抗體實(shí)際與特異性抗原結(jié)合的區(qū)域。B.抗體的特異性區(qū)域可以通過(guò)親和色譜進(jìn)行非選擇性純化，在該過(guò)程中，配體 （蛋白 A、G、L）是結(jié)合在分離介質(zhì)上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于純化特異性蛋白。這種情況下，抗體作為中間配體為其抗原提供選擇性。
兩類親和色譜中，在不影響蛋白質(zhì)（或標(biāo)簽） 和配體間作用力的條件下，蛋白質(zhì)均在柱上保留。在不破壞特異性相互作用但可破壞所有雜蛋白與固定相間其非特異性作用的條件下，對(duì)所有結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行淋洗。*后用含有競(jìng)爭(zhēng)分子的緩沖液或者可破壞所有蛋白質(zhì)間相互作用的條件對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行洗脫。
競(jìng)爭(zhēng)分子可代替目標(biāo)蛋白與配體相結(jié)合。這種競(jìng)爭(zhēng)分子可通過(guò)其他層析手段或者透析的方式從目標(biāo)蛋白中去除。通過(guò)破壞所有蛋白間相互作用來(lái)從固定相洗脫蛋白的方法包括調(diào)節(jié)緩沖液的pH值或者離子強(qiáng)度。因?yàn)檫@些方法同樣會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，因此通常建議洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)要立即中和或者稀釋以將危害降到*小。有報(bào)道稱，對(duì)于不同形式的親和層析，為獲得*高產(chǎn)率的活性蛋白需采用多種不同的流動(dòng)相條件 。
| 目標(biāo)蛋白 | 配體伴隨 | 洗脫 |
| 問(wèn)題 | 原因 | 解決方法 |
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